Nature：免疫系统不认“脸”，只认“伤”？“细胞破损”才是拉响过敏警报的通用语言

要想在分子层面解开过敏之谜，首先需要一个能够稳定重现过敏反应的 犯罪现场 。在人体中直接研究这些早期事件既不现实也不道德，因此，研究人员的首要任务是在实验室的培养皿中，建立一个能够模拟真实气道过敏反应的体外模型(in vitro model)。

他们选择的 嫌疑对象 是交链格孢菌(Alternaria alternata)，一种在环境中无处不在的霉菌。它不仅是引发呼吸道过敏的主要元凶之一，全球高达20%的过敏人群对它 情有独钟 ，而且在小鼠模型中也能稳定地诱发典型的过敏性气道炎症。可以说，它是研究过敏的 完美罪犯 。

研究人员首先在小鼠身上确认了交链格孢菌诱导过敏的核心特征。他们发现，当小鼠吸入这种霉菌的提取物后，其气道上皮细胞(airway epithelial cells) 我们呼吸系统的第一道防线 会迅速作出反应。这种反应可以被归纳为三个关键的 生物学指纹 ：

1. 释放 警报素 白细胞介素-33(Interleukin-33, IL-33)：IL-33是一种强大的免疫信号分子，被誉为启动2型免疫反应的 主开关 。当上皮细胞受损时，它会被释放出来，像烽火台的狼烟一样，向整个免疫系统发出警报。

2. 激活MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)：这是一条细胞内的 信息高速公路 ，负责将来自外界的刺激信号传递到细胞核，调控基因的表达。研究人员通过免疫荧光染色发现，在接触霉菌提取物后，小鼠气道上皮细胞中的MAPK通路关键蛋白MEK1/2和ERK1/2被大量磷酸化，标志着这条通路已被全面激活。

3. 上调一系列炎症基因的表达：被激活的MAPK通路会 指令 细胞核生产大量的炎症介质，如趋化因子(chemokines)和细胞因子(cytokines)，这些物质负责招募更多的免疫细胞前来 支援 ，从而放大炎症反应。

有了这三个清晰的 指纹 ，研究人员便转向了培养皿。他们使用人类肺上皮细胞系 (NCI-H1437)，加入交链格孢菌的提取物。令人兴奋的是，细胞在体外完美地重现了小鼠体内的所有早期反应：IL-33被释放，MAPK通路被激活，同样的炎症基因开始 高歌猛进 。

这个巧妙搭建的体外模型至关重要。它就像一个便携式的 犯罪现场模拟器 ，让研究人员可以在可控的环境下，对交链格孢菌提取物这个复杂的 混合物 进行分离和测试，从而找出真正导致这三种生物学指纹出现的 核心犯罪分子 。探案的第一步，也是最关键的一步，已经完成。

有了可靠的体外检测平台，接下来就是一场经典的生物化学 寻宝 之旅。研究人员的目标，是从成分复杂的交链格孢菌提取物这锅 汤 中，把具有免疫刺激活性的蛋白质给 钓 出来。

他们首先对这锅 汤 的性质做了初步判断。通过加热或用蛋白酶处理，他们发现免疫刺激活性都消失了，这说明 元凶 是蛋白质。接着，通过超滤实验，他们发现活性分子的分子量大于3千道尔顿(kDa)，进一步证实了这一点。

于是，一场包含六个步骤的生物化学纯化(biochemical fractionation)大戏拉开了帷幕。这个过程就像用不同规格的 筛子 去筛选混合物，每一步都分离出性质不同的组分，并用前面建立的体外模型去检测哪一份还保留着活性。

研究人员依次使用了硫酸铵沉淀、HiTrap S离子交换层析、Mono S离子交换层析等技术。在前两步纯化中，一个有趣的现象出现了：所有三种活性（诱导IL-33释放、激活MAPK、促进炎症基因表达）总是 抱团取暖 ，在相同的组分中被洗脱下来。这强烈暗示，这三种看似不同的细胞反应，很可能是由相同或紧密关联的蛋白质组分所触发的。

然而，当纯化进行到第四步 Superdex 75凝胶过滤层析时，一个意想不到的 案情转折 发生了。这一步根据分子大小来分离蛋白质。研究人员惊讶地发现，无论是大分子量组分（A4-A6）还是小分子量组分（A9-A12），单独拿出来都无法刺激细胞。它们就像失去了法力的魔术师，突然变得 沉默 了。

难道是活性物质在纯化过程中被破坏了？研究人员没有轻易下结论，他们尝试了一个简单的操作：将大分子量组分和小分子量组分重新混合在一起。奇迹发生了！混合物恢复了全部的免疫刺激活性。在NCI-H1437细胞中，混合物诱导的IL-33释放水平从几乎为零飙升到超过100个单位，AREG基因的表达也增加了近50倍，同时MAPK通路被强烈激活。

这个发现是整个研究的突破口。它表明，交链格孢菌的 过敏武器 并非单一成分，而是一个需要至少两种组分协同作战的 二人组 。研究人员将这个小分子量组分命名为 组分A(component A) ，大分子量组分命名为 组分B(component B) 。

接下来的任务就清晰了：分别对这两个组分进行 终极纯化 ，并揭开它们的真实身份。

对于组分A，在Superdex 75层析的最后一步中，研究人员在银染的SDS-PAGE凝胶上看到一条清晰的16.5 kDa的条带，其出现与免疫活性完美对应。通过质谱分析(mass spectrometry)，这条带的身份被锁定为一种埃格罗里溶素家族蛋白(aegerolysin family protein)。这类蛋白在真菌中很常见，以其在细胞膜上 打孔 的能力而闻名。

对于组分B，研究人员又进行了两步纯化。最终，在凝胶上出现了两条分别在30 kDa和20 kDa的蛋白带，与活性高度相关。质谱分析揭示，这两条带实际上是同一个55 kDa蛋白质的N端和C端片段，而这个蛋白质含有一个膜攻击复合物/穿孔素(membrane attack complex/perforin, MACPF)结构域。MACPF蛋白也是一类著名的 打孔蛋白 。

更有趣的是，在真菌中，aegerolysin和MACPF蛋白常常 搭档 出现，形成二元穿孔毒素(pore-forming toxins, PFTs)，共同作用于细胞膜并导致细胞裂解。而且，编码这两种蛋白的基因在交链格孢菌的基因组中竟然是定位在一起的 邻居 。

至此， 元凶 的身份水落石出。它们就是被研究人员命名为Aeg-S（aegerolysin small，即16.5 kDa的组分A）和Aeg-L（aegerolysin large，即55 kDa的组分B）的两种蛋白质。它们联手合作，共同构成了交链格孢菌引发过物反应的核心武器。

缉拿归案 之后，研究人员需要搞清楚这两个 罪犯 是如何协同 作案 的。为此，他们动用了现代结构生物学的 火眼金睛 冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)技术，来直接观察Aeg-S和Aeg-L在细胞膜上形成的复合物的精细结构。

首先，他们通过体外实验证实，Aeg-S和Aeg-L这对组合，对特定的细胞膜成分具有高度的亲和力。它们只结合由鞘磷脂(sphingomyelin)和(cholesterol)组成的脂质体，而对由磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)组成的脂质体则 不屑一顾 ，显示出高度的靶向特异性。

当把这两种蛋白与鞘磷脂-胆固醇脂质体混合后，在电子显微镜下，研究人员看到了令人震撼的景象：原本光滑的脂质体表面，布满了大量环状的孔洞结构，就像被微型钻孔机打出了一排排整齐的孔。

为了获得更高分辨率的图像，研究人员利用cryo-EM技术，最终解析出了这个孔道复合物高达3.81埃（ ）的近原子分辨率结构。这个结构揭示了一个庞大而又高度有序的 杀伤机器 。它由18个Aeg-L蛋白和36个Aeg-S蛋白组成，形成一个巨大的、具有18重对称性的环状结构。整个复合物的外径约232 ，而其中心的 杀戮通道 内径宽达92 。这个尺寸足以让各种离子、ATP甚至一些小分子自由进出细胞，对于细胞来说，这是一个致命的 大窟窿 。

结构模型显示，Aeg-S蛋白二聚体首先像 地基 一样锚定在细胞膜上，然后招募Aeg-L蛋白前来组装。每一个Aeg-L蛋白都与两个Aeg-S蛋白以及相邻的Aeg-L蛋白紧密相连，形成一个异常稳定且对称的三角形支架。这种多点连接的网络结构，不仅保证了孔道的稳定性，也解释了为何需要两种蛋白协同作用。

更有趣的是，通过与AlphaFold2预测的Aeg-L单体 休眠 状态结构进行比较，研究人员发现，在形成孔道时，Aeg-L蛋白N端结构域中的两个原本 隐藏 的 -发夹结构( -hairpins)会像弹簧刀一样被释放出来，插入到细胞膜中，完成了从水溶性到膜插入的构象转变。

这幅清晰的 杀手肖像 ，不仅展示了Aeg-S和Aeg-L如何协同在细胞膜上 钻孔 ，也为我们理解其如何触发免疫反应提供了直观的物理基础。这个巨大的跨膜孔道，无疑是对细胞完整性的严重破坏，是免疫系统不可能忽视的 危险信号 。

看清了 作案工具 的模样，下一个问题是：这个在细胞膜上凿出的 天坑 ，究竟是如何拉响免疫系统的 警报 的？研究人员通过一系列巧妙的细胞实验，揭示了其中的双重机制。

他们使用重组表达的Aeg-S和Aeg-L蛋白处理人类肺上皮细胞。结果发现，只有当两者同时存在时，细胞才会作出反应，这与之前的纯化实验结果完全一致。单独的Aeg-S或Aeg-L都无法引起任何波澜。

第一重警报：物理损伤与 警报素 释放

当Aeg-S和Aeg-L的浓度足够高时，它们形成的孔道会直接导致细胞膜的破裂，这是一种典型的裂解性细胞死亡(lytic cell death)。伴随着细胞的死亡，其内部储存的 警报素 ，如IL-33和ATP（三磷酸腺苷），就会被动地释放到细胞外环境中，直接向周围的免疫细胞发出最高级别的危险信号。这就像一个城堡的城墙被直接炸开，里面的信使冲出去求援。

第二重警报：钙离子内流与MAPK通路激活

然而，更有趣的发现发生在 亚致死 浓度(sub-lytic levels)下。在这些浓度下，Aeg-S和Aeg-L形成的孔道还不足以立即杀死细胞，但已经足以在细胞膜上打开一个 缺口 。研究人员发现，即使在没有明显细胞死亡的情况下，MAPK信号通路仍然被强烈激活，并且大量的炎症基因被诱导表达。这说明存在一种更为精细的感知机制。

研究人员将目光投向了钙离子(Ca ⁺)。细胞内外维持着巨大的钙离子浓度梯度，胞外钙离子浓度远高于胞内。细胞膜上的任何 破洞 都会不可避免地导致胞外钙离子的大量涌入。他们使用钙离子荧光探针Cal-520来监测细胞内的钙离子浓度。果不其然，在加入Aeg-S/L后，细胞内的荧光信号急剧增强，在约500秒时达到峰值，表明大量的钙离子正涌入细胞。

这股钙离子 洪流 是关键吗？为了验证这一点，研究人员使用了两种不同的钙离子螯合剂。一种是可穿透细胞膜的BAPTA-AM，它能同时清除胞内和胞外的钙离子；另一种是不能穿透细胞膜的EGTA，它只能阻断来自胞外的钙离子。

结果非常清晰：无论使用BAPTA-AM还是EGTA，都能有效地抑制Aeg-S/L诱导的MAPK通路激活和下游炎症基因的表达。这有力地证明了，正是由细胞膜穿孔导致的胞外钙离子内流，是激活MAPK通路、触发炎症反应的上游关键事件。

至此，整个信号链条被完整地建立起来：

Aeg-S/L形成孔道 胞外Ca ⁺内流 激活MAPK信号通路 诱导炎症基因表达 启动2型免疫反应

这个双重机制完美地解释了细胞的反应模式：低剂量的穿孔蛋白会通过钙离子信号通路 悄悄地 启动炎症程序，而高剂量的穿孔蛋白则通过直接的物理损伤和细胞死亡，释放出更强烈的 警报素 ，从而引爆全面的免疫应答。

培养皿中的发现固然激动人心，但要证明它在真实生物体内的意义，还必须回到动物模型中。研究人员将纯化的重组Aeg-S和Aeg-L蛋白，通过鼻腔滴注的方式，直接送入小鼠的呼吸道，模拟自然吸入霉菌的过程。

结果与预期完全一致。单独给予Aeg-S或Aeg-L，小鼠的肺部安然无恙。然而，一旦将两者联合使用，一场教科书式的过敏性气道炎症便爆发了。仅6小时后，小鼠的气道上皮细胞中就检测到了显著的MAPK通路活化和炎症基因表达，与交链格孢菌提取物的作用如出一辙。

当连续给药两周后，小鼠表现出所有典型的过敏症状：

肺部嗜酸性粒细胞大量浸润：与对照组相比，Aeg-S/L处理组小鼠肺部的嗜酸性粒细胞数量从几乎为零激增了数十倍。

Th2细胞显著聚集：在肺部的CD4+ T细胞中，Th2细胞的比例从对照组的约5%上升到Aeg-S/L组的近20%。

血清IgE水平急剧升高：Aeg-S/L组小鼠血清中的总IgE浓度比对照组高出约10倍。

这些数据表明，Aeg-S和Aeg-L的协同穿孔作用，是充分且必要地在体内诱导过敏性气道炎症的关键。它们完美地模拟了整个交链格孢菌提取物的致敏效果。

更有趣的是，为了厘清信号的先后顺序，研究人员在IL-33基因敲除小鼠和淋巴细胞缺陷的Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中重复了实验。他们发现，即使在没有IL-33或适应性免疫细胞（如ILC2）反馈的情况下，Aeg-S/L依然能够有效地激活气道上皮细胞中的MAPK信号通路。这说明，上皮细胞对穿孔的感知和初级反应（即MAPK激活）是一个非常早期的、不依赖于后续免疫应答的自主行为。

在免疫学中，物质可以扮演不同的角色。有些物质是抗原(antigen)，即被免疫系统识别并攻击的 靶子 ；而另一些物质是佐剂(adjuvant)，它们自身可能不作为主要攻击目标，但能极大地增强和指导免疫系统对抗原的反应类型。佐剂就像战场上的 煽动者 ，决定了战争是以 空战 （如抗体反应）还是 陆战 （如细胞毒性反应）为主。

那么，Aeg-S和Aeg-L究竟是抗原还是佐剂？或者两者都是？为了回答这个问题，研究人员设计了一组经典的佐剂效应实验。他们使用了两种常见的模型抗原：卵清蛋白(ovalbumin, OVA)和交链格孢菌的主要蛋白抗原Alt a 1。

当单独给小鼠注射OVA或Alt a 1时，免疫系统几乎没有反应，T细胞保持沉默，血清中也检测不到抗原特异性的IgE。这说明这些蛋白质本身是 无害 的。

接下来，研究人员将这些抗原与不同的 佐剂 混合。作为对照，他们使用了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，一种著名的细菌成分，是启动1型和3型免疫反应的强力佐剂。当LPS与OVA混合后，小鼠产生了强烈的针对OVA的Th1（分泌IFN- ）和Th17（分泌IL-17A）细胞反应，但几乎没有产生Th2细胞反应和特异性IgE。这符合LPS作为1/3型佐剂的经典角色。

而当Aeg-S/L组合与OVA或Alt a 1混合后，情况则完全不同。小鼠产生了非常强劲的、针对抗原的Th2细胞反应（分泌IL-4和IL-13），并且血清中充满了抗原特异性的IgE抗体。然而，Th1和Th17反应则完全缺席。例如，在OVA+Aeg-S/L组中，OVA特异性的IL-4和IL-13水平分别高达约20 pg/ml和400 pg/ml，而OVA+LPS组中则几乎检测不到。

这些结果清晰地揭示了Aeg-S和Aeg-L的一个核心功能：它们是一种高效且特异的2型免疫佐剂(type 2 immune adjuvant)。它们通过在细胞膜上 打孔 这一行为，为免疫系统创造了一个独特的 环境 ，专门引导免疫反应走向过敏性的Th2方向。这也解释了为何有些物质会引发过敏，而另一些则引发其他类型的炎症 关键可能在于它们激活了何种类型的佐剂信号通路。

到目前为止，所有的证据都指向Aeg-S和Aeg-L是 元凶 。但要将这个案子办成 铁案 ，还需要一个决定性的证据：证明在天然的交链格孢菌中，正是这两个蛋白在发挥作用。

为此，研究人员利用基因编辑技术，分别构建了Aeg-S基因敲除(aegs KO)和Aeg-L基因敲除(aegl KO)的交链格孢菌突变株。

他们首先在体外测试了这些突变株提取物的 毒力 。结果是惊人的。与野生型霉菌提取物相比，两种基因敲除株的提取物都完全丧失了诱导肺上皮细胞IL-33释放、激活MAPK通路和表达炎症基因的能力。它们变成了 被拔了牙的老虎 。

更具说服力的是 回补实验 (rescue experiment)。当研究人员在aegs KO提取物中重新添加纯化的Aeg-S蛋白，或在aegl KO提取物中添加Aeg-L蛋白后，所有的免疫刺激活性都神奇地被恢复了。

体内实验的结果也同样有力。当给小鼠滴注野生型霉菌提取物时，小鼠出现了严重的过敏性气道炎症。然而，给予aegs KO或aegl KO提取物的小鼠，其肺部几乎和健康小鼠一样，没有嗜酸性粒细胞浸润，也没有Th2细胞聚集和IgE水平的升高。而一旦在这些 无害 的提取物中加入相应的重组蛋白，其致敏能力便被完全恢复。例如，在aegs KO提取物处理的小鼠中，肺部嗜酸性粒细胞数量接近于零，而加入Aeg-S蛋白后，该数值回升到与野生型处理组相当的水平（约8 x 10⁶个细胞）。

这一系列的基因敲除和回补实验，提供了强有力的遗传学证据，证明了Aeg-S和Aeg-L是交链格孢菌天然致敏性中不可或缺的核心组分。它们的穿孔活性，是这种常见霉菌引发过敏的根本原因。

这项研究最激动人心的部分，或许还在于它的普适性。Aeg-S/L的故事只是关于一种霉菌。那么，这种 通过细胞穿孔来诱导2型免疫反应 的机制，是否可能是一种更广泛的 通用法则 呢？

为了探索这一点，研究人员测试了来自各种不同物种、结构和靶点也各不相同的多种穿孔毒素(PFTs)。其中包括：

来自另一种霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)的NigA2/NigB1；来自海葵毒液的海葵毒素II(Equinatoxin II, Eqt II)；来自蚯蚓的溶素蛋白(Lysenin)；来自产气荚膜梭菌的穿孔素O(Perfringolysin O, PFO)等等。

这些PFTs的 武器库 五花八门，有的靶向鞘磷脂，有的靶向胆固醇，有的靶向糖类；它们形成的孔道大小也从3纳米到45纳米不等。然而，当把这些重组蛋白分别滴注到小鼠气道中时，一个惊人一致的结果出现了：所有这些不同的PFTs，无一例外地都诱导了强烈的过敏性气道炎症，表现为显著的嗜酸性粒细胞和Th2细胞浸润，以及血清IgE水平的升高。

在机制上，这些PFTs也同样能诱导上皮细胞释放IL-33，并以不依赖IL-33的方式激活MAPK通路和炎症基因表达，这与Aeg-S/L的作用机制完全一致。

这一发现意义非凡。它将研究的结论从 一种霉菌的致敏机制 提升到了 一类通用危险信号的识别模式 。它表明，我们的气道上皮细胞进化出了一种能力，能够将细胞膜穿孔本身作为一种统一的、需要启动2型免疫反应的危险信号来感知，而不管这个 孔 是由谁、用什么工具、如何 钻 出来的。

这或许可以解释为何许多看似无关的物质，如某些霉菌过敏原和毒液，都能够引发2型免疫。它们共享了一个共同的 作案手法 破坏细胞膜的完整性。

这对我们意味着什么？

这项发表于《自然》的研究，不仅为我们破解了交链格孢菌引发过敏的核心机制，更重要的是，提出了一个关于过敏反应启动的全新范式。

过去，我们常常在成千上万的过敏原中寻找共同的分子特征，结果却屡屡碰壁。这项研究告诉我们，或许应该转换思路：免疫系统感知的可能不是过敏原 是什么 ，而是它们 做了什么 。对于一大类过敏原而言，它们共同的 语言 就是对细胞膜的物理性穿孔。我们的免疫系统将这种 细胞被钻孔 的事件，为需要启动2型免疫反应的信号 这是一种旨在排除大型入侵物（如寄生虫和毒液）的古老防御机制。

这一发现为过敏性疾病的治疗开辟了全新的视野。传统的治疗方法，如抗组胺药或激素，大多是针对下游的炎症症状。未来的治疗策略，或许可以更加 治本 ，直接靶向上游的触发事件。例如，我们是否可以开发药物来抑制由穿孔引起的胞外钙离子内流，或者阻断下游的MAPK信号通路？这样的药物有望对由多种不同穿孔蛋白引发的过敏都有效，从而实现 广谱 抗过敏治疗。

当然，过敏的世界依然充满谜题。许多常见的过敏原，如花粉和尘螨，似乎并不具备直接的穿孔活性。它们又是如何启动2型免疫反应的呢？它们是否通过其他方式造成了类似的 组织扰动(tissue perturbations) ？这些问题，将是未来研究者们继续探索的方向。而这项关于 细胞穿孔 的研究，无疑为他们提供了一块至关重要的拼图，让我们离最终解开过敏之谜又近了一步。