Cell Death and Disease：类器官模型揭示 ULBP2 CAR-T 细胞对胃癌的杀伤作用

样本来源

关键试剂

详细步骤

肿瘤组织用含 2 mM 谷氨酰胺和 10% FBS 的 DMEM/F12 洗涤后，用剪刀剪碎为小块；

加入 0.1 mg/mL 胶原酶 IV，37 C 恒温消化 30 分钟，期间轻柔震荡；

加入等量洗涤培养基终止消化，通过 100 m 细胞筛过滤，收集筛上的细胞团；

300 g 离心 5 分钟，弃上清，细胞团重悬于 50% Matrigel 与 50% 类器官培养基的混合液中；

以 50 L 液滴形式接种到预热的 24 孔板中央，37 C、5% CO₂培养箱中静置 30 分钟使 Matrigel 固化；

每孔加入 0.5 mL 类器官培养基，每 3-4 天更换一次培养基，观察类器官生长状态。

2. 类器官与癌相关成纤维细胞（CAFs）的共培养

目的

模拟肿瘤微环境中类器官与 CAFs 的相互作用，研究 ULBP2 对 CAF 活化的影响。

关键试剂

预冷磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶、共培养培养基、Matrigel。

详细步骤

类器官从 Matrigel 中解离，用预冷 PBS 反复洗涤以去除残留基质，计数后重悬于共培养培养基；

贴壁培养的 CAFs 用胰酶消化，离心后重悬于共培养培养基并计数；

按比例混合类器官与 CAFs，加入 Matrigel 和共培养培养基，制成 50 L 液滴接种到 24 孔板；

37 C、5% CO₂下固化 30 分钟，加入 0.5 mL 共培养培养基，每 2-3 天换液；

共培养 6 天后，收集培养基、类器官及 CAFs，用于后续检测（如 -SMA 免疫荧光染色、细胞因子检测等）。

3. 类器官的检测方法

形态学观察

通过倒置显微镜观察类器官的大小、形态及增殖状态，记录生长动力学。

免疫荧光染色

固定类器官后，用抗 Ki-67（增殖标志物）、抗 ULBP2 抗体孵育，荧光二抗显色，DAPI 染核，通过共聚焦显微镜观察蛋白表达与定位。

细胞毒性实验

将 ULBP2 CAR-T 细胞与类器官按不同效靶比（E:T）共培养，通过 LDH 释放法检测类器官杀伤率，计算 CAR-T 细胞的特异性杀伤能力。

二、CAR-T 细胞制备与功能检测技术

1. 抗 ULBP2 单克隆抗体（mAb）的制备

免疫方案

6 周龄 C57BL/6 小鼠经皮下多点注射 1 10⁶稳定表达 ULBP2 的 HEK-293T 细胞，共免疫 3 次；末次免疫后 5 天，用 2 10⁶相同细胞加强免疫。

抗体生产

采用 Microfluid-based Antibody Tech（MBAT）技术，通过脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，筛选特异性识别 ULBP2 的单克隆抗体。

2. ULBP2 CAR 的构建与慢病毒生产

CAR 结构

第二代 CAR，包含抗 ULBP2 单链可变片段（scFv）、人 CD8 铰链区和跨膜区、4-1BB 共刺激域、CD3 信号域（图 5A）。

慢病毒生产

关键试剂：HEK-293T 细胞、Lenti-CAR 质粒、psPAX2（包装质粒）、pMD2G（包膜质粒）、Lipofectamine 2000、0.45 m 滤膜。

步骤：HEK-293T 细胞接种于 10 cm 培养皿，18 小时后按比例共转染 CAR 质粒、psPAX2 和 pMD2G；6 小时后换液，60 小时后收集上清，1000 g 离心 10 分钟去除细胞碎片，0.45 m 滤膜过滤，浓缩病毒液备用。

3. ULBP2 CAR-T 细胞的制备与功能验证

T 细胞分离

从人外周血单个核细胞（PBMCs）中用 EasySep Human T Cell Isolation Kit（STEMCELL, 17951）富集 CD3⁺ T 细胞。

活化与转导

T 细胞用 CD3/CD28 磁珠（Gibco, 11131D）以 1:2 比例活化，加入 10 ng/mL IL-2；24 小时后加入慢病毒液，32 C、1000 g 离心 90 分钟转导，10 小时后换液。

功能检测

杀伤实验：LDH 法检测 CAR-T 细胞对 ULBP2⁺胃癌细胞系（如 MKN-45）及类器官的杀伤效率（图 5D、G）。

细胞因子检测：ELISA 法检测共培养上清中 IFN- 和颗粒酶 B 的浓度，评估 CAR-T 细胞的活化程度（图 5E）。

三、动物模型构建技术

1. 细胞系衍生异种移植（CDX）模型

细胞准备

MKN-45 细胞稳定表达 ULBP2 和萤火虫荧光素酶（MKN-45-ULBP2-T2A-Luc），调整浓度为 3 10⁶ cells/100 L。

接种与处理

6 周龄 NSG 小鼠右侧皮下注射 100 L 细胞悬液（含 50% Matrigel）；待肿瘤体积达 90 mm 时，尾静脉注射 6 10⁶ ULBP2 CAR-T 细胞，联合组每 5 天腹腔注射 10 mg/kg 抗 PD-1 抗体。

监测

通过生物发光成像监测肿瘤生长，定期测量肿瘤体积和小鼠体重，记录生存期（图 6B-D）。

2. 患者来源异种移植（PDX）模型

组织接种

新鲜胃癌组织切成 10 mm 小块，皮下接种到 6 周龄 NSG 小鼠，进行 serial transplantation 至第三代（P3）。

治疗与检测

P3 代小鼠肿瘤达 90 mm 时，按 CDX 模型方案处理；终点时收集肿瘤组织，进行 HE 染色、Ki-67 免疫组化及 CD8⁺ T 细胞浸润检测（图 7E-G）。

四、分子与细胞生物学检测技术

1. 基因编辑技术（CRISPR/Cas9）

目的

敲除胃癌细胞系（如 SNU-216、MKN-45）中的 ULBP2 基因，研究其功能。

步骤

设计 ULBP2 特异性 gRNA（序列见表 S2），构建 pLentiCRISPR-V2 载体；转染胃癌细胞，嘌呤霉素筛选稳定敲除细胞系，通过流式细胞术和 Western blot 验证敲除效率（图 2A）。

2. 转录组与通路分析

RNA 测序

提取 ULBP2 敲除与野生型 MKN-45 细胞的总 RNA，进行转录组测序，筛选差异表达基因（DEGs）。

通路富集

利用 GO 和 KEGG 数据库对 DEGs 进行富集分析，发现 TGF- 信号通路和 ECM - 受体相互作用是主要受影响的通路（图 3B、C）。

3. 免疫组织化学（IHC）与组织染色

IHC 检测

肿瘤组织石蜡切片脱蜡后，用抗 ULBP2、Ki-67、CD8 抗体孵育，DAB 显色，苏木素复染；通过 H-score（染色强度 阳性细胞比例）定量蛋白表达（图 1G、7F）。

基质染色

Masson 三色染色和 Sirius 红染色检测肿瘤组织中胶原的沉积量，评估基质致密程度（图 1I、7H）。

科普说明

类器官

一种在体外由干细胞或肿瘤细胞培养形成的 3D 结构，具有与来源器官相似的组织学特征和功能，能更好地模拟体内微环境，是研究肿瘤生物学和药物筛选的理想模型。

CAR-T 细胞

通过基因工程改造的 T 细胞，表达能特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR），可精准杀伤肿瘤细胞，目前在血液肿瘤中疗效显著，本研究探索其在实体瘤（胃癌）中的应用。

PDX 模型

将患者肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，保留了原肿瘤的异质性和微环境特征，是评估新疗法临床转化潜力的 金标准 模型。

关键结果图表

该研究针对胃癌（GC）治疗中存在的致密基质微环境、缺乏有效治疗靶点及 CAR-T 细胞疗法在实体瘤中疗效有限等问题展开，提出猜想：ULBP2 可能通过激活 TGF- 信号通路促进癌相关成纤维细胞（CAFs）活化，参与胃癌进展，而靶向 ULBP2 的 CAR-T 细胞或许能有效抑制胃癌，联合抗 PD-1 抗体可增强疗效。