Nature Biotechnology ：里程碑式突破！研究人员成功建立具备生殖系传递潜能的通用鸟类胚胎干细胞系

失落的方舟：鸟 类干细胞研究为何 难于上青天 ？

要理解这项突破的意义，我们首先需要明白，为何之前的路总是走不通。

胚胎干细胞，被誉为生命科学领域的 万能种子 。它们源自早期胚胎，拥有两大 神力 ：其一是多能性 (pluripotency)，即在理论上可以分化成构成身体的所有类型的细胞，从跳动的心肌细胞到传递信息的神经元；其二是生殖系传递能力 (germline competence)，当这些细胞被重新注入一个早期胚胎并发育成嵌合体动物后，它们能够进入生殖腺，最终形成精子或卵子，从而将自身的遗传信息传递给下一代。

正是这第二种能力，让小鼠胚胎干细胞成为了基因编辑的 黄金载体 。研究人员可以在体外对小鼠ES细胞进行精准的基因改造，然后筛选出成功编辑的细胞，将其注入囊胚，就能获得携带特定基因修饰的后代。这一流程化的技术，催生了数以万计的基因敲除小鼠模型，彻底改变了现代生物医学研究的范式。

然而，这套在小鼠身上玩得炉火纯青的技术，在鸟类身上却屡屡碰壁。过去几十年来，全球各地的实验室都曾尝试建立鸟类的ES细胞系。虽然也分离出了一些 貌似 干细胞的细胞系，但它们都有一个致命的缺陷：在体外培养传代数次后，就会迅速失去那宝贵的 神力 ，特别是形成嵌合体和进入生殖系的能力会急剧下降甚至完全丧失。这些细胞就像失去了魔力的灰姑娘，一旦过了某个 时间点 ，就变回了普通的模样。

这种持续的失败，甚至让学界产生了一种主流假说：鸟类的生殖细胞起源模式可能与哺乳动物根本不同。在小鼠中，生殖细胞是由外胚层细胞 (epiblast cells) 在特定信号 诱导 下形成的；而在鸟类中，它们可能是在卵子形成过程中，由母源物质 预先决定 的。如果真是这样，那么从外胚层细胞建立的ES细胞，或许从一开始就 命中注定 无法转化为生殖细胞。这无疑为鸟类ES细胞的研究蒙上了一层厚厚的阴影，仿佛一条无法逾越的鸿沟。

柳暗花明：培养皿中的 蛋黄 竟是破局关键？

这项研究的突破，始于一个非常巧妙的观察。

研究人员的起点，是刚刚产下的鸡蛋中的早期胚胎 处于EGK.X分期的鸡胚盘 (blastoderm)。他们首先尝试了哺乳动物干细胞培养中常用的 鸡尾酒配方 ，筛选了一系列小分子抑制剂。很快，他们发现，当同时抑制Wnt信号通路（使用抑制剂IWR-1）和PKC信号通路（使用抑制剂G 6983）时，培养皿中出现了形态良好的未分化细胞集落。这似乎是一个不错的开端。

然而，老问题再次出现。这些细胞虽然在初期看起来很 干 ，但在传代一到两次后，便开始不可避免地走向分化，无法长期维持。正当研究陷入僵局时，一个细节引起了他们的注意：在分离胚胎盘的操作中，如果 不小心 带入了更多的残留蛋黄，这些细胞的生长状态似乎会更好。

这个偶然的发现，如同黑暗中的一道闪电，照亮了前行的方向。研究人员大胆假设：或许，蛋黄中含有某种神秘的、对维持鸡ES细胞多能性至关重要的活性成分！

为了验证这个猜想，他们设计了一个直接的实验：在之前发现的 双抑制剂 (2i) 培养基中，直接添加了3%的蛋黄。结果令人振奋！原本只能维持几天的ES细胞，在添加了蛋黄后，奇迹般地实现了稳定增殖，可以连续不断地传代培养，并且始终保持着典型的未分化形态。无论是来自受精蛋还是未受精蛋的蛋黄，都同样有效。这意味着，他们终于找到了那把失落已久的钥匙，成功打开了长期维持鸟类ES细胞的大门。这个全新的培养体系，他们称之为 Yolk/2i 。

分子侦探的追寻：从蛋黄 汤 中 钓 出神秘功臣

找到了 藏宝图 （蛋黄），下一步就是找出宝藏本身。蛋黄是一个成分极其复杂的混合物，里面有成百上千种蛋白质、脂质和各类分子。究竟是哪一个或哪几个分子在发挥关键作用？接下来，研究人员上演了一场精彩的 分子侦探 大戏。

他们的策略是生物化学分离纯化 (biochemical fractionation)，就像用不同规格的筛子，从一堆沙石中逐步筛选出金子一样。

第一步：粗筛 血浆与颗粒。他们通过高速离心，将蛋黄分成了上清液（血浆，plasma）和沉淀物（颗粒，granules）。分别测试后发现，促进细胞自我更新的活性，全部存在于血浆部分。目标范围缩小了。

第二步：中筛 按分子量大小。他们利用不同孔径的分子量截留膜 (molecular-weight cutoff membrane)，将蛋黄血浆进一步分成了三组： 100 kDa、50-100 kDa和 50 kDa 的组分。测试结果非常明确：只有50-100 kDa这个区间的组分，能够有效地维持ES细胞的未分化状态。侦探的目光，已经锁定在了一个更精确的范围内。

第三步：精筛 蛋白沉淀。针对50-100 kDa的活性组分，他们使用了经典的硫酸铵沉淀法 (ammonium sulfate precipitation)。通过逐步提高硫酸铵的浓度，可以让不同的蛋白质先后从溶液中沉淀出来。他们发现，当硫酸铵饱和度达到80%时沉淀下来的那部分蛋白（简称80p），展现出了最强的促进ES细胞自我更新的活性。

最后一步：验明正身 质谱分析。研究人员将这个 80p 组分通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，发现在大约75 kDa的位置有一条非常明显的蛋白条带。他们切下这条带，送去做质谱分析 (mass-spectrometry analysis)。最终的鉴定结果水落石出 这个神秘的功臣，就是鸡卵中的一种主要蛋白质：卵转铁蛋白 (ovotransferrin)。

为了最终确认，他们直接用市售的纯化卵转铁蛋白，代替了整个蛋黄组分。结果完美复现！卵转铁蛋白与两种抑制剂（IWR-1和G 6983）的组合，就足以在体外长期稳定地培养鸡ES细胞。有趣的是，他们还测试了卵转铁蛋白在哺乳动物中的 亲戚 血清转铁蛋白 (serum transferrin)，却发现它完全没有效果。这有力地证明了卵转铁蛋白在维持鸟类多能性方面，扮演着一个物种特异性的、不可替代的角色。

不止于鸡：一套 配方 解锁多样鸟类的生命密码？

既然已经破译了鸡ES细胞的 培养密码 ，一个更宏大的问题摆在了面前：这套配方，能否通用地应用于其他鸟类？毕竟，鸟类世界的多样性远不止于鸡。

研究人员立刻将他们的新配方 OT/2i （卵转铁蛋白+双抑制剂）应用到了其他几种重要的鸟类身上，包括雉（pheasant）、鸭（duck）和火鸡（turkey）。很快，新的挑战出现了。虽然这些物种的胚胎细胞在OT/2i培养基中也能形成ES细胞样的集落，但它们会迅速地、自发地分化成跳动的心肌细胞 (cardiomyocytes)。培养皿中出现成片搏动的细胞，这虽然景象壮观，但对于维持干细胞而言却是一个坏消息。

这意味着，不同鸟类对信号通路的精细调控存在差异。通过进一步的筛选，研究人员发现，在OT/2i的基础上，再添加一种名为SB431542的抑制剂，可以有效地阻断这种心肌细胞分化。SB431542能够抑制Activin/Nodal信号通路，该通路在心脏发育中起着关键作用。这个升级版的 三抑制剂 配方 OT/3i ，成功地让雉、鸭和火鸡的ES细胞也稳定了下来。

然而，当他们转向鹌鹑 (quail) 时，OT/3i配方又不够用了。鹌鹑ES细胞仍然无法长期维持。通过不懈的尝试，他们发现，必须额外添加一种细胞因子 鸡抑制因子 (chicken leukemia inhibitory factor, chLIF)，才能最终 驯服 鹌鹑ES细胞。

至此，一个更加强大和通用的鸟类ES细胞培养 鸡尾酒 配方， OT/3i/chLIF ，正式诞生。利用这个终极配方，研究人员势如破竹，成功地从鸡、鹌鹑、鹅、鸭、火鸡、雉乃至美丽的孔雀 (peafowl)等七种不同的鸟类中，建立了稳定的ES细胞系。

更有趣的是，这套配方也揭示了物种间的微妙差异。例如，在鸵鸟 (ostrich) 身上，OT/3i配方是有效的，但一旦加入chLIF，反而会诱导细胞分化。深入的转录组分析揭示了原因：鸵鸟ES细胞中LIF受体的表达水平远高于其他鸟类，导致它们对LIF信号 过度敏感 。这说明，即使是保守的信号通路，在不同物种中也可能存在一个最佳的 活性窗口 ，过犹不及。

终极试金石：这些细胞是真正的 全能王者 吗？

建立了细胞系只是第一步，更关键的问题是：这些在培养皿中生长了数十代的细胞，是否还保持着ES细胞真正的 灵魂 多能性和生殖系能力？研究人员动用了一系列 火眼金睛 般的现代生物学技术，对它们进行了全方位的严格 体检 。

身份鉴定：它们在发育时钟上处于什么位置？

通过RNA测序 (RNA-sequencing)，研究人员读取了这些细胞中所有活跃的基因信息，绘制出它们的 分子身份证 。主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA)的结果显示，这些体外培养的鸡ES细胞，在基因表达谱上与它们最初的来源，EGK.X期的胚胎盘细胞，高度相似，而与更早或更晚发育阶段的胚胎细胞则明显不同。这证明，他们的培养体系成功地 定格 住了胚胎发育中那个特定的、充满潜能的瞬间。

更有深度的是，他们将鸡ES细胞的基因表达谱与小鼠不同多能性状态的干细胞（包括原始态naive、形成态formative和始发态primed）进行了跨物种比较。结果发现，鸡ES细胞与小鼠的形成态多能性干细胞 (formative pluripotent stem cells)最为相似。这是一个非常重要的结论。形成态被认为是介于 一切皆有可能 的原始态和 蓄势待发 的始发态之间的一个关键过渡阶段，这个阶段的细胞已经为响应分化信号做好了准备。这与鸡胚在产蛋时的发育状态（已经历了部分早期分化）高度吻合，也解释了为何这些细胞在体外能迅速分化。

能力测试之一：嵌合实验见真章

证明多能性的黄金标准，是看它们能否在真实胚胎中 大显身手 。研究人员将这些ES细胞用绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein, GFP)标记上，然后将它们小心地注射回一个正常的、未标记的早期鸡胚中。这个过程就像是给一支军队派去了 特种兵 ，看它们能否融入并参与作战。

结果令人惊叹。在体外（ex ovo，一种模拟孵化的培养系统）和体内（in ovo，在蛋壳内）的嵌合实验中，这些发出绿色荧光的ES细胞，都完美地整合进了宿主胚胎中，并随着胚胎的发育而增殖、分化。在发育的胚胎中，可以看到闪亮的绿色细胞广泛地分布在各个组织和器官中，包括正在形成的神经管（未来大脑和脊髓的雏形）、体节（未来肌肉和骨骼的来源）等等。

他们还发现，提高嵌合效率有一个诀窍：在注射ES细胞之前，用适度的亚致死剂量辐射 (sublethal irradiation)（500-550 cGy）处理宿主胚胎。这种辐射可以清除一部分宿主自身的细胞，为外来的ES细胞 腾出 更多的生态位，从而使得嵌-合-体中供体细胞的比例大大提高，形成了高等级嵌合体 (high-grade chimeras)。

能力测试之二：羽毛作证的功能性整合

为了提供更直观、更具功能性的证据，研究人员进行了一项极为巧妙的实验。他们从一种羽毛呈棕色的鸡品种，罗德岛红鸡 (Rhode Island Red)，建立了ES细胞系，然后将其注入到一种羽毛纯白的鸡品种，白来航鸡 (White Leghorn)，的胚胎中。

几个月后，奇迹发生了。从这些嵌合胚胎中孵化出的雏鸡，长大后身上出现了非常明显的 混色羽毛 在原本纯白的羽毛中，点缀着一块块棕黑色的区域。这生动地证明了，来自罗德岛红鸡的ES细胞，在白来航鸡的身体里成功分化成了功能性的黑素细胞 (melanocytes)，并产生了色素。通过显微镜观察和分子标记染色（MITF染色），他们进一步确认，这些有颜色的羽毛区域，确实充满了来自供体鸡的、表达GFP的细胞。

能力测试之三：触及圣杯，它们能成为生殖细胞吗？

这是所有测试中最核心、也最令人期待的一项。这些ES细胞是否具备生殖系能力？

研究人员细致地观察了嵌合体胚胎的生殖腺 (gonads)发育过程。在发育到第9天的雄性嵌合胚胎的睾丸中，他们发现了成簇的、同时表达GFP（供体细胞标记）和DAZL（一种关键的生殖细胞标记蛋白）的细胞。在发育到第15天甚至更晚的胚胎中，这些源自ES细胞的生殖细胞簇变得更大，并且开始表达另一种生殖细胞表面抗原SSEA-1。在即将孵化的E21胚胎中，他们甚至观察到，这些GFP阳性的生殖细胞，已经成功地迁移并定居在了生精小管 (seminiferous tubules)内部 这正是未来产生精子的地方。

这些层层递进的证据，有力地证明了，他们建立的鸟类ES细胞，确实拥有分化成原始生殖细胞 (Primordial Germ Cells, PGCs)的能力。它们不仅是 万能 的，更是 可传承 的。

开启鸟类生物学新纪元：一把 基因剪刀 的无限可能

证明了这些细胞的真实身份后，研究人员立即展示了它们作为基因工程平台的巨大潜力。他们使用强大的CRISPR-Cas9基因编辑技术，对携带GFP基因的鸡ES细胞进行了一次 外科手术 ，成功地将GFP基因的原序列修改，使其转而表达蓝色荧光蛋白 (Blue Fluorescent Protein, BFP)。流式细胞术分析显示，基因编辑的效率非常可观，有9.3%的细胞实现了完全的GFP到BFP的转换。这清楚地表明，这些细胞是理想的基因编辑 操作台 。

这项研究的成功，意味着鸟类生物学研究的工具箱，终于被补上了最关键的一块拼图。它所带来的变革将是深远而广泛的：

基础研究的 加速器 ：研究人员终于可以像在小鼠中那样，系统性地制造基因敲除鸡，来研究特定基因在鸟类独特的胚胎发育、免疫系统、行为模式以及对禽流感等病毒的反应中的功能。无数悬而未决的科学问题，如今都有了被解答的可能。

现代农业的 新引擎 ：在家禽育种领域，传统方法耗时漫长且效率有限。利用这项技术，未来可以对鸡、鸭、鹅等家禽进行精准的基因改良，培育出抗病能力更强（例如抵抗禽流感）、生长速度更快、产蛋品质更优或饲料转化效率更高的新品种，为保障全球粮食安全提供强大的技术支持。

生物医药的 新工厂 ：鸟类的蛋，特别是鸡蛋，是一个天然的、高效的 生物反应器 。通过对鸡ES细胞进行基因编辑，未来可以培育出能在蛋清中大量生产高附加值药用蛋白（如抗体、疫苗、酶等）的 工程鸡 ，从而大幅降低某些昂贵药物的生产成本。

濒危物种的 诺亚方舟 ：许多鸟类正濒临灭绝，保护其遗传多样性迫在眉睫。这项技术可以被用来建立濒危鸟类的ES细胞库，相当于为其物种基因组建立了一份 活的备份 。在未来，这些细胞或许可以通过跨物种嵌合等技术，帮助恢复濒危物种的数量，甚至为复活渡渡鸟等已灭绝鸟类的宏伟设想，提供了一丝理论上的可能。

当第一只 设计鸟 破壳而出

当然，任何一项开创性的研究，在迈出决定性的一大步后，总会留下一些等待完善的细节。该研究中，研究人员也坦诚地指出，尽管他们已经充分证明了ES细胞能够形成生殖细胞并定居于生殖腺，但他们尚未完成最终的 临门一脚 ，即通过这些嵌合体鸡，成功获得由ES细胞产生的后代（即生殖系传递）。他们分析，这很可能是由于实验中所使用的不同鸡品种之间存在品系不相容性 (strain incompatibility)，导致高等级的嵌合体胚胎在孵化后期死亡率较高。

然而，这更像是一个技术层面的工程挑战，而非原理上的根本障碍。通过使用遗传背景更匹配的供体和受体品系，这个问题在未来的研究中很有可能被解决。

毫无疑问，这项研究的核心成就，建立稳定、可传代、可编辑且具备生殖系能力的鸟类胚胎干细胞，已经为整个领域奠定了一块坚实无比的基石。它不仅填补了长达数十年的技术空白，更重要的是，它彻底改变了游戏规则。

我们可以预见，在不远的未来，第一只由基因编辑ES细胞产生的 设计鸟 ，将破壳而出。到那时，我们将不仅能更深刻地理解这些翱翔于天际的美丽生灵，更将拥有一种前所未有的强大力量，去守护它们、改良它们、并借助它们来改善我们人类自身的生活。这扇刚刚被开启的大门背后，是一个充满无限可能的崭新世界。